蛋白质及肽的N末端氨基酸DNS
分析法——聚酰胺薄膜层析技术
[目的]
1．掌握聚酰胺薄膜层析技术的基本方法和应用。
2．熟悉蛋白质及肽的N末端氨基酸DNS分析法。
[原理]
荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称DNS-C1)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质)，DNS-蛋白质再经酸水解可释放出DNS-氨基酸，其反应式如下：
DNS-C1能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB法高100倍。将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。DNS-氨基酸衍生物在6mol/L盐酸中105℃水解22小时，除DNS-色氨酸全部被破坏，DNS-脯氨酸(77％)，丝氨酸(35％)，甘氨酸(18％)，丙氨酸(7％)部分被破坏外，其余DNS-氨基酸很少破坏。故DNS法可用于蛋白质和肽的氨基酸组成N末端分析。
DNS-C1与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε-氨基和酚羟基反应，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏；DNS-ε-赖氨酸和DNS-O-酪氨酸较稳定，同时还有DNS-双-赖氨酸和DNS-双-酪氨酸生成，层层后在层析图谱的位点上，都与DNS-α-氨基酸有区别。
DNS-C1在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，即：
在DNS-C1过量时，会产生DNS-NH2，即：
DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄色荧光，而DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光，可彼此区分开。
DNS-氨基酸在酸性条件下(pH2～3)一般都可被乙酸乙酯抽提，然后取乙酸乙酯层点样 层析，这样大量DNS-C1的反应副产物DNS-OH可留于水相，干扰因素减少，所得层析图谱清晰。但若是DNS-精氨酸，DNS-天冬氨酸，DNS-谷氨酸，DNS-苏氨酸，DNS-丝氨酸则它们大部分或部分留于水相，往往会被遗漏，而导致错误结论。这时可将样品浓缩干，用甲醇直接溶解后点样，由于上述DNS-氨基酸的层析位置都位于DNS-OH的右侧，影响不大，这一点在测定多肽或蛋白质的N末端时要特别注意。
DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0.01μg(相当于10—10mol)。聚酰胺薄膜层析是1966年后发展起来的一种新层析技术。由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。在用于分析测定氨基酸衍生物方面超过了过去使用的纸层析、纸电泳、硅胶薄板层析等方法。
聚酰胺是—类化学纤维原料，即锦纶(又称尼龙)。由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶66 。
因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的一C＝O及>NH基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类<如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。在层析过程中，层层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。
聚酰胺薄膜是在涤纶片基上涂上一层锦纶薄膜制成的。
[操作方法]
1．标准氨基酸的DNS化
称取2.3μmol层析纯的氨基酸(一般可将氨基酸的Mr分为100、150、200三个等级，相应的称量为0.23mg、0.34mg、0.46mg左右)，溶于0.5mL 0.2mol／L碳酸氢钠溶液中。然后，取0.1ml于具塞玻璃试管中，加入0.1mLDNS-C1丙酮溶液，检查pH，用1mol／L氢氧化钠调pH至9.0一9.5，于室温(20℃左右)下放置2～4小时。贮备于暗处备用。按后面所述层析溶剂系统，做DNS-氨基酸的标准图谱。亦可用商品标准DNS-氨基酸制作层析图谱。
2．蛋白质的氨基酸组成的DNS分析
取1～5nmol的蛋白质或肽的样品置水解管中，加0.3ml 5.7mol/L恒沸点盐酸，在真空或通氮下封管，于110℃烘箱中水解18～24小时。水解后，开管，真空蒸发除去盐酸，加少量无离子水，再蒸干，重复2～3次以除尽盐酸。加入0.5mL 0.2mol/L碳酸氢钠溶液，转移到玻管中，加入0.5mLDNS-C1丙酮溶液，用l mol／L氢氧化钠调pH至9.0～9.5，混匀，塞好，放 40℃烘箱中保温2小时，或室温(20℃左右)放置2～4小时。在反应过程中样品由黄色转变为浅绿至白色。然后将玻管放置真空干燥器中蒸去丙酮。加少量水，用1 mol/L盐酸调pH至2～3。再用乙酸乙酯抽提2～3次，每次约用0.5mL，在细长滴管中分层，将上层抽提液合并于指形管，抽去乙酸乙酯，保存于干燥器中。用前加少量丙酮溶解。按操作方法4进行层析。对照DNS-氨基酸标准图谱(图6-2，图6-3，图6-4)，便可鉴定出各种氨基酸。由此得知蛋白质样品的氨基酸组成。
3．蛋白质及肽的N末端氨基酸的DNS分析
取0.2～0.5mg胰岛素(或其他可供分析用的蛋白质或肽)，置于具塞玻管中，用少量水溶解后，加入0.5mL 0.2mol/L碳酸氢钠溶液，再加入0.5mLDNS-C1丙酮溶液，用l mol/L氢氧化钠调pH至9.0～9.5，塞好，于40℃烘箱保温2小时，或室温下放置2～4小时。反应后，真空蒸去丙酮，用0.5ml5.7mol／L盐酸移至水解管，抽真空封管。于110℃水解18-24小时，开管后蒸去盐酸，加少量水，再蒸干，重复2-3次以除尽盐酸，临用前加几滴丙酮，然后按操作方法4层析。对照胰岛素N末端DNS-氨基酸标准图谱(图6-5)，可初步确定蛋白质样品的N末端氨基酸(已知胰岛索A、B链的N末端分别为甘氨酸和苯丙氨酸)。
4．样品的聚酰胺薄膜层析法
(1)聚酰胺薄膜的裁剪：将聚酰胺薄片裁剪成7cm×7cm方块。在距边0.5cm处画互为垂直的二条基线，其交叉点即为点样位置。如只做单向，只在一边画一基线，在上面每隔1 cm画—点作为点样位置。
(2)点样：用毛细管取样，点在聚酰胺薄膜点样位置上，点子直径不得超过2mm，若需要多次点样时，应当将**次样品点吹干后，再点**次。
(3)展层：将点完样的聚酰胺薄片光滑面向外，聚酰胺面向内，箍以线圈或胶片圈(将旧的35 mm照相底片在1 mol／L氢氧化钠溶液中煮沸4小时，然后用水冲洗干净，做成小箍即可用)。层层容器用小干燥器或小钟罩(可自制，用—般试剂瓶把底去掉，将下边磨干，塞住瓶口，放在玻璃板上即可)，内放一小培养皿，倒入5-10 mL展层溶剂进行展层，以溶剂前沿走到距边约0.3cm为度(约10～20分钟)，取出薄片，然后用吹风机吹干。
展层溶剂系统：
①甲酸(88％)：水＝1. 5：100(V／V)。
②苯：冰乙酸＝9：1(V／V)。
⑧乙酸乙酯：甲醇：冰乙酸＝20 ：1：1(V／V／V)。
④0.05 mol／L磷酸三钠溶液：乙醇＝3：l(V／V)。
若只需单向层析即用系统(1)，要进行双向层析时，为了便于吹干，可先用系统(2)，(3)(4)为第1向，展层后取出再用系统(1)为第Ⅱ向，这样可节省时间。但有时遇到聚酰胺薄膜质地不均匀，如先用系统(2)展层后就有“爆皮”现象，无法再走第Ⅱ向。遇到这种情况仍可用系统(1)为第1向。但展层后因含水，需要充分吹干，*好晾过夜，次日再走第Ⅱ向。DNS-混合氨基酸层析图谱表示于图3-11，系统(2)+(3)是先做系统(2)，取出后在同一方向再用系统(3)层析，只要走1／2的距离，目的是把DNS-谷氨酸和DNS-天冬氨酸，DNS-苏氨酸和DNS-丝氨酸， DNS-丙氨酸和DNS-NH2分开。DNS-碱性氨基酸层析图谱表示于图3一13，用系统(4)把 DNS-精氨酸，DNS-组氨酸，DNS-ε-赖氨酸分开。
(4)检测；DNS-氨基酸用波长360 nm或280 nm的紫外灯检测，在图谱上除看到呈黄色荧光的DNS-氨基酸斑点外，还有其他颜色的杂点，这是囚为试剂中含少量氨和杂质。DNS- C1试剂水解产物含DNS-OH，但容易区分，不影响鉴定。而DNS-NH2和DNS-丙氨酸可用系统(3)区别开。
[试剂]
以下试剂均用分析纯(或保证试剂)，溶液要用重蒸水配制。
1．各种层析纯标准氨基酸
2．样品；胰岛素或其他可供分析用的蛋白质或肽。
3．DNS-C1丙酮溶液：配制成2.5mg／mL丙酮溶液，贮于棕色瓶中，置冰箱保存，1个月内稳定。
4．5.7mol／L重蒸盐酸或6mol/L盐酸
5．1 mol／L盐酸
6．1 mol/L氢氧化钠
7．0.2mol／L碳酸氢钠溶液
8．苯
9．冰乙酸
10．88％甲酸
11．甲醇
12．乙酸乙酯
13．0.05mol／L磷酸三钠溶液
14．乙醇
[器材]
1．聚酰胺薄膜：上海摩速科学器材有限公司有售021-56902220。可以反复使用，层析后用丙酮和25％～ 28％浓氨水(9：1，V／V)，或用丙酮和90％甲酸(9，1，V／V)浸泡6小时，把污物洗去，再用甲醇洗涤，晾干后可再使用。
2．小干燥器或小钟罩
3．真空干燥器
4．具塞磨口试管(5mL)及指形样品管
5．毛细管
6．水解管(硬质玻璃)
7．烘箱
8．紫外分析仪
9．细长滴管
10．小培养皿
附：正常人血清中氨基酸的DNS化：
在有塞小试管中(内有经预处理的血清)加pH9.8的0，2MNaHCO30.2m1，测pH8-9，加DNS-Cl丙酮液0.2m1，充分摇匀，放入40℃温箱保温30分钟，去塞后保温15分钟。取出后用 1 N HCl酸化至pH2-3(注意用*小体积，从一滴加起)，若酸化过份，pH<2-3。可用1 NNaOH校回，再加水饱和的乙酸乙酯l m1，摇匀。待分层，吸取上层乙酸乙酯液于另一小试管中(注意不要吸水相)，原管再加乙酸乙酯1 m1，同上摇匀分层。吸上层液于同一小试管中，80一90℃水浴蒸干后加无水乙醇50μl，摇匀后点样。
正常血清DNS-氨基酸的双向层析
取一张7×7cm聚酰胺薄膜。在左下角距两边各0.6cm处点上血清DNS-氨基酸。点样时，用毛细玻管吸取DNS-氨基酸无水乙醇液，点样直径控制在2-3mm之间，可重复点几次以提高浓度。点样量以紫外灯下能见—明亮的荧光点为佳。点样后，将膜卷拢放在苯一冰醋酸溶液系统中作为**向层析(点样处在下，向上层析)。待溶剂前沿到达离顶端约3mm处取出。用电吹风或电风扇吹干，直到无冰醋酸味为止，在紫灯外下观察层析情况。然后调转90℃与**向垂直向再以甲酸一水作为**向层析。用电吹风热、冷风交替吹干，以去除残存溶剂，在紫外灯下观察结果，并用铅笔轻轻描出各荧光点位置。对照标准图谱可确定各荧光点分别是哪种 DNS-氨基酸。 -
器材
紫外灯、40℃温箱，电吹风、毛细玻管、滴管、小试管、层析缸、铅笔、直尺、pH试纸
试剂：
正常人血清预处理：取0.5ml正常人血清于离心管中，加无水乙醇1.5ml，沉淀蛋白质(注意无水乙醇要求一滴一滴地加，且一边加一边摇)，置冰箱(4℃)2小时后离心，取上清液于具塞小试管中，置80-90℃蒸干备用。
(二)凝胶层析(分子筛层析)
凝胶层析是指混合物随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。凝胶颗粒是一类具有三维空间多孔性网络结构的物质，不带电荷，可起滤过或“筛”的作用，故又称为凝胶过滤或分子筛层析(gel chromatography)。
在实际操作中，把合适的凝胶颗粒装填在层析柱内(玻璃或塑料制品)，再把待分离的混合物自柱顶加入，然后用合适的洗脱液进行洗脱。在洗脱过程中，混合物中各物质主要依据分子的大小进行层析分配，分子量大的物质，因分子的直径较大，不能进入凝胶颗粒的网孔内，而被排阻在凝胶颗粒外部，即只分布在凝胶颗粒的间隙中，沿着这些间隙流动，这样，它们流速较快，在洗脱液的“冲洗”下，先洗出柱外。那些分子量小的物质，因分子的直径较小，能够进入凝胶颗粒的网孔，也即被滞留在凝胶颗粒内部。在洗脱过程中，这些较小分子的洗脱行为是先在孔隙中间扩散，然后进入凝胶颗粒内部，再被洗出至孔隙，再进入颗粒内部。如此不断的入出和出入，直至这些物质被洗出住外。由于洗脱的“路径”较长，因而它们被后洗脱出来。总之在洗脱液的洗脱下，混合物中分于量*大的物质*先出柱，分子量*小的物质*后出柱；介乎中间的物质，则分子量愈大洗出愈快，分子量愈小洗出愈慢。这样，不同的物质就被分离。
葡聚糖凝胶层析过程见图6-6。
混合物中各物质在凝胶柱内层析时的洗脱行为和各自的分配系数Kd有关。
Kd＝(Ve一Vo)／Vi式中；Kd为样品组分在两相间(凝胶颗粒内部和外部)的分配系数，Ve为洗脱体积，即被分离物质通过层析柱(完全洗脱出来)所需的洗脱液体积(m1)。在实际工作中，是从加样起算，到该组分*大浓度即洗脱峰顶出现所需的洗脱液体积，Vo为层析柱床中溶胀凝胶颗粒间隙中液体所占的体积(m1)，即空隙的总容积，也称外水体积。实际工作中，可用已知被完全排阻的大分子物质测得，如蓝色葡聚糖一2000 (blue dextran 2000)，分子量为 2000kdal。Vi为层析柱中溶胀凝胶颗粒内部所含水相的总体积(mi)，也称内水体积，可由凝胶重量(g)相得水值Wa的乘积(即g·Wa)求得。
Kd是衡量溶质分子被阻滞程度的一个特征性常数。某一物质的Kd值，只要测得其Vo，就可通过上式求得。以上关系可用下图来表示。在洗脱过程中，被洗脱成分的洗脱行为可以有三种可能的情况：
(1)Ve=Vo，表示被洗脱的某成分流经层析柱全程所需的洗脱液体积和凝胶颗粒间隙的总体积相等。也就是说，该成分的分子全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，而未进入凝胶颗粒内部，因而洗脱速度*快，被*先洗脱出来。即该成分的Kd＝0。(图6-7中组分a)
(Z)Vi＝Ve-Vo表示某成分被洗脱出来所需洗脱液的总体积和凝胶颗粒外部孔隙的总体积之差，等于凝胶颗粒内部的总体积。也就是说，该成分不被排阻而可完成进入凝胶颗粒内部，即被滞留。因而洗脱速度*慢，被*后洗脱出来。即该成分的Kd=l。(图6-7中组分c)
(3)Kd值介于0一l之间，大多数被分离物质都属于这种情况。在此范围内，物质的洗脱速度随其Kd值的增加而降低，Kd值越大，被排阻的程度越小，即被滞留的程度越大，洗脱速度越慢；反之，Kd值越小，被排阻在外的程度越大，洗脱速度越快。一般物质的Kd值是0<Kd< l。(图4-7中组分b)
在实际工作中，应用较广的是天然琼脂糖凝胶和人工合成的交联葡聚糖凝胶，前者的商品名为Sepharose，后者为Sephadex。
下表为葡聚糖凝胶(G)类的技术数据
